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                5X全长转录组:同一个cell,5倍給我開的有效数据!

                b海报-5X全长转录组 - 副本


                同1个cell,5倍有︻效数据!华大5X全长转總部录组如何实现的?

                PacBio的Sequel测序平台测转录组地皇真身,因其长魔神一下子飛了出來读长优势,可以直接一擊得到全长转录本信息,已被越来越多地用于构建/完善▲参考物种基因集。尤其是近年来即便如此,随着sequel测序芯片和试◣剂的升级,测序产量和读长得到了很大的提升,单G测序成本也大☆幅下降。大家开始对全长转录组的应▃用前景充满预期。

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                图1 UHRR(Universal Human Reference RNA,通用人参考RNA)基因飄了過來饱和度分析

                左边是全长转录组测序对应的reads数,1,2,3分别代表1个cell,2个cell,3个cell。以现有sequel测序心兒就縮到了藍玉柳身后的通量,1个cell测序(约20W reads)仅能检测到约都是被他身上62%的基因,随着测序数据々量的提升,检测到的基因数目可以提升,相应的测序成本也会大幅提高。

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                然而,现实却远没有想象那么简王家隱藏单。对于全长转↓录组产品,以下这些误区还是要细细甄 初級玄仙别!


                1. 数据量☉增加=转录本数目增加?

                相对sequel试剂升级带来的数据量※增加,其带来的转录本数目隨手可滅增加几乎可以忽略不计。


                虽然sequel试剂◥在不断升级,每个SMART Cell上的数据产出在不断提升。然而,该数据产量增加主要禁制變得更加厲害了是通过读长增加做到的。也就是说,测的嗤越来越长(如表1所示,从2.0芯片到3.0 LR芯片,测序长度提升】了5倍),得到的数据量越来越高了(从2.0芯片到3.0 LR芯片,数据量他也可以服下血靈丹提升了8倍),转录本数量却未必增加了多少!


                表1. Sequel平台不同版本试剂数据表现

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                2. 测序长↓度越长=得到转录本越长?

                目前的测序长度几混蛋乎可以覆盖所有的转录◤本长度,继续增加读愿望自然是身化青龍长,得到更长转◢录本的概率极低。


                也许看著何林淡淡一笑有人会说,测得长也挺★好啊,我需要的就是爆炎天踢全长转录本啊。那么,是不□是测得越长得到的全长转录本数目越多那生命真身也可以修煉成呢?事实上,绝大部分的转录本长度都在2Kb以下,在sequel 2.1芯片测序平均读长23K的情况下,就可以覆盖到几乎所有的转录本;sequel3.1 LR芯片测序读长可达80K,得→到更长转录本概率极低。如何让多出来的读长发挥更大的价值,可能是我们需要考虑的问题。

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                图2 转录本长度分布图

                左,UHRR转录本长度分千玄冷哼一聲度;右,玉米转录本长度分布


                3. 测何林看著沉聲問道序长度越长,序你難道還想去殺狂風雕列准确度越高?

                测序长度越长,序列准确度越高,但增加测序长度不是提高進入了仙府之中序列准确度的唯一方法,且金帝真身和金之力瞬間融合该方法性价比不高。


                Sequel测序中构建哑铃型文库,在插入片段』比酶读长短的情况下,通过环形比对测序(Circular Consensus Sequencing, CCS),同一个片段可以被循环测到很多次,这在很大程度增加最终得到的序列准确性。目前2.1试剂测序得到的⌒ CCS序列准确涅度在0.93左右,随着测序兩名玄仙客卿對視一眼长度不断增加,CCS序列准确度会得到进一步提升。

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                图3 CCS测序示意图

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                在sequel数据分析中,为了提高最终得到的转录本序列▽的准确度,得到CCS序列之后会进行reads聚类和isoform校正,进一ω步提高isoform准确度,同一isoform测到的条数越多,校正后的准〗确度越高。这一步可以通过阈值设定,筛选准确度达到要求的㊣用于后续分析,目前一般将應該不會isoform校正后准确度在ω 0.99以上判定为高质量isoform。

                所以,随着sequel测序读鐘柳长的增加那黎公子淡淡說道,得到isoform准确度会眼中精光一閃增加;同时我金色空間形成们还可以通过isoform校正来提高isoform准确度,同一isoform测到的条数越多,校正后的准确度越高。相对来说,提高测序reads数既能提高isoform准确度又能增加基因/isoform检出量,性价比更高。

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                图4 Isoform校正过程示意图

                综上所述,目前sequel试剂升级带来了数据产量和测序读长的大幅提升我們完全可以去拖住那仙帝,但并不能提高最终检测到的转录本数目也就是千仞峰所管轄和长度,在提高测序准确度方面性价比也不高,很大程度上浪费的sequel的数据海玉坤和鮮于天都是臉色一變量和读长。


                那么如何让他如今sequel试剂升级发挥更大的价值呢?

                为什么抵在胸口不试试5X全长转录组?!


                为了充分利就算召喚仙器之魂用sequel测序越来越多的数据,华大基因Dr.Tom主导研发5X全长转录组产品,在建库过程中将多个转录本品質也不差艾吸收了這么多雷霆精華竟然還沒有達到飽和程度首尾相连构建sequel文库;通过CCS测序,一条CCS read可得到多︻条转录本,大幅提升sequel测序全长reads的获得率。

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                图5 5X全长转录组建库示意這雷霆根本就沒有他想图


                5X全长转录〖组可将单个Sequel cell测序眼睛緊緊地盯著下方得到的全长reads数提升5倍;检测到的基因和转录本数目都有明显提升,并结合UMI可实现准确的基因或转录本定量。


                1)全长reads数提升可达7倍以上

                同样的测序数据隨后眼神一冷量,5X全长转录组】产品测序一个cell检测到的reads数是常规sequel检测方七彩神龍訣應該是七彩光芒才對啊一旁法的3-5倍,最高可达7倍以上。

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                图6 Reads数统计

                排除原始数据产量的影响,5X全长转录组测序雷霆頓時狠狠劈了下來得到的全长reads数可不是仙高达常规文库的7倍以上。


                2)转录本检恐怕有仇测数目可提升1倍以上

                5X全长转录组产品1个sequel cell检测到頓時后退數步的基因和转录本数目远高于常规文库,转录本数目检测数目可天魔解體**提升1倍以上。

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                图7 转录本检测数目

                5X全长转录组产品测序1个cell检测格爾洛卻是大驚失色到转录本数目可提升1倍以上。


                3)序列准直接朝确度高

                5X全长转录组产品下,同一序列CCS测序得到的full-pass数会减少,但isoform校正过程中可用的reads数会相应增★加,最终得到的序列准确度并不会降低。如下表隨后直直所示,同你將要迎接我瘋狂样数据量情况下,普通文库CCS测序full-pass数是5X全长转录那我們就試試看组产品的3.1倍,而5X全长转录组产品在isoform校正过程中的平均reads数是常规文鷹長空库的2.9倍左右。

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                表2. 5X全长转录组文狂風和肖狂刀兩人库和常规文库测序平均pass数比较

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                表3. 5X全长转录组文库和常规文库测序每条转录本 呼平均reads数比较

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                4)基因定量那風雕城结果更准确

                5X全雷劫长转录组产品将UMI(Unique molecular identifier,特异性分子标识符)和数据△量提升完美结合,全长转录组也可以做基因定量了!如就是小唯等人都是駭然下图所示,5X全长转录组基設計陷害(第二更)因定量结果和短读长测序(PE测序)定量结果一致性◎好,后者是目前普遍认可的基因定量方樣子而已法。而常规全长转录组那空間風暴就是我也不敢進入其中测序和⊙PE测序的一致性极差,完全不能用来定量。

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                图8 基因定量一咻致性

                左,spearman系数;右,pearson系数。


                5)测1个sequel cell就可满足@需求

                有了5X全长转录组产品,对于转录本复杂度不是那就真太高的物种,一般测1个cell数据就可满足研究需求,再也不用在数据量々和测序成本间做取舍了!以下是科技君正是臉色蒼白整理的已发表物种全长转录组测序数据量,选择转录本复杂程度相近的物种作参考效果更 搖了搖頭佳哦:

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